Jaburetox e Soyuretox

As ureases são “protoxinas”, que são clivadas por enzimas digestivas do próprio inseto, liberando um peptídeo de ~10 kDa, que é letal (Carlini et al., 1997; Ferreira-Dasilva et al., 2000).  Versões recombinantes desse peptídeo foram obtidos por expressão heteróloga em bactérias ou leveduras.  Entre esses, destacamos a família de peptídeos Jaburetox (Jbtx) derivados da isoforma II de urease de C. ensiformis – JBURE-IIb, e o Soyuretox (Sytx), derivado da isoforma ubíqua da urese de soja (Glycine max)(mestrado de Karine Kappaun, 2014), ambos expresso em Escherichia coli e com cauda polihistidina  purificação por cromatografia de afinidade. Esses peptídeos também são fungitóxicos, e têm  potencial biotecnológico para o desenvolvimento de plantas transgênicas com resistência a insetos pragas e fungos fitopatogênicos.

JbureII-Jbtx

Esquema mostrando a localização do peptídeo Jaburetox (Jbtx), de 91 aminoácidos, em relação à sequência de 841 aminoácidos da urease JBURE-II de Canavalia ensiformis.

O primeiro peptídeo recombinante obtido foi o jaburetox-2Ec, com potente efeito inseticida (0,01% m/m na dieta), inclusive contra insetos que não são susceptíveis às ureases inteiras (Mulinari et al.,2004; 2007, Tomazetto et al., 2007).  O jaburetox-2Ec mostrou-se inócuo se injetado ou por via oral, em ratos e camundongos. Posteriormente, a molécula foi otimizada para conter somente a sequência derivada da urease JBURE-II, resultando no peptídeo chamado simplesmente Jaburetox (Jbtx) (Postal et al., 2012).

O Jbtx, semelhante à urease inteira,  inibe a diurese em túbulos de Malpighi de R. prolixus, em dose de 10-15 a 10-12 M. O peptídeo interfere nos níveis de GMP cíclico e no potencial transepitelial dos túbulos de Malpighi, enquanto o efeito da urease inteira envolve alteração na rota dos eicosanóides (Stanisçuaski et al., 2009).  O Jbtx afeta a permeabilidade de lipossomos  (Barros et al., 2009; Martinelli et al., 2014), é neurotóxico causando bloqueio da junção neuromuscular de insetos (Martinelli et al., 2014 – colaboração com Cháriston Dal Belo) e induz a formação de canais iônicos cátion-seletivos em membranas lipídicas planares (Piovesan et al., 2014- colaboração com o Dr. Jean-Louis Schwartz, Univ. Montreal, Canadá). A permeabilização de membranas fúngicas também foi observada, acompanhando o efeito fungitóxico promovido pelo peptídeo (Postal et al., 2012), sendo que o soyuretox também é antifúngico (mestrado de Karine Kappaun). Com as Dra. Beatriz Settembrini, do Museo Argentino de Ciencias Natulares, Buenos Aires, e a Dra. Lílian Canavoso, Univ. Nacional de Córdoba, Argentina,  estudamos os efeitos neurotóxicos do jaburetox-2Ec após injeção no barbeiro Triatoma infestans, como paralisia das patas e movimentos desordenados das antenas.  No cérebro dos insetos tratados detecta-se importante inibição da óxido nítrico sintase, bem como a presença do peptídeo, interagindo com células específicas do tecido nervoso. A enzima UDP-N-acetilglicosamina pirofosforilase foi identificada como um provável receptor do Jbtx no cérebro de T. infestans (Galvani et al., 2014).

Modelo da estrutura tridimensional do jaburetox-2 (a) e comparação com as estruturas de neurotoxinas de escorpião: (b) neurotoxina tipo-a BMK M1, um bloqueador de canais de Na+ (PDB ID: 1djt); (c) neurotoxina tipo-b (PDB ID: 1b3c) e (d) BMKK4 (PDB ID: 1s8 k).  Em destaque (amarelo), o domínio grampo-beta e a alfa-hélice, comum a essas toxinas e a peptídeos formadores de poros em membranas. (Modificado de Barros et al., 2009).

Modelo da estrutura tridimensional do jaburetox (a) e comparação com as estruturas de neurotoxinas de escorpião: (b) BMK M1, um bloqueador de canais de sódio (PDB ID: 1djt); (c) neurotoxina tipo-b (PDB ID: 1b3c) e (d) BMKK4 (PDB ID: 1s8 k). Em destaque (amarelo), o domínio grampo-beta e a alfa-hélice, comum a essas toxinas e a peptídeos formadores de poros em membranas. (Modificado de Barros et al., 2009).

Em colaboração com Cristian Follmer (UFRJ) e com Nádya P. Silveira (IQ-UFRGS), mostramos que o jaburetox-2Ec é capaz de se inserir em membranas, alterando a permeabilidade de lipossomos (Barros et al., 2009). O peptídeo oligomeriza em pH entre 5-6, pH característico do trato digestório dos insetos suscetíveis às ureases (Carlo Moro, 2010).

A modelagem molecular do Jaburetox sugeriu a presença de um grampo beta anfipático, e uma estrutura similar a de toxinas bloqueadoras de canais iônicos, e peptídeos bacterianos formadores de poros em membranas, como as protegrinas. Por meio de mutagênese sítio-dirigida, estudo das relações de estrutura-função foram realizados (Martinelli et al., 2014 -colaboração com Dr. Giancarlo Pasquali, UFRGS) para esclarecer a importância do grampo beta.  Obtivemos três mutantes: um correspondente ao Jbtx sem o domínio grampo-beta, outro correspondente à metade N-terminal do peptídeo e o terceiro, à metade C-terminal do peptídeo.

Jbtx 5 conformers

Os paineis A, B e C mostram cada um 5 diferentes confôrmeros do Jbtx conforme dados de RNM. Em cada painel, as estruturas foram sobrepostas para evidenciar pequenas regiões mais organizadas, que poderiam servir de “gatilhos” para aquisição de estrutura 3D do peptídeo na interação deste com ligantes (retirado de Lopes et al., 2015).

Análises da atividade inseticida e do efeito bloqueador da junção neuromuscular em baratas, mostraram que a porção N-terminal do Jbtx é responsável pelo efeito entomotóxico. Ainda que o mutante correspondente ao C-terminal do Jbtx (porção que contém o grampo-beta) também interaja com membranas, sozinho este não produziu efeitos entomotóxicos (Martinelli et al., 2014).

Em colaboração com o Dr. Stefano Ciurli, a estrutura 3D do Jaburetox foi determinada por ressonância nuclear magnética (Lopes et al., 2015). Observou-se que o peptídeo é desorganizado e altamente flexível em solução aquosa, comportando-se como uma Proteína Intrinsicamente Desordenada, uma classe de proteínas sem conformação secundária, e por essa razão, capazes de interagir com muitos ligantes (Uversky, 2002; 2009). Uma possível interação do Jbtx com lipídeos fúngicos ou de insetos que conduza a uma conformação biologicamente ativa é uma das hipóteses que vem sendo investigada no laboratório.

Estão em andamento experimentos para obtenção de plantas de milho (colaboração com Magali Grando, UPF), cana-de-açúcar (colaboração com as Dras. Arlete Becker-Ritt e  Helaine Carrer, ESALQ-USP) e soja transgênicas (colaboração com a Dra. Maria Helena Zanettini, UFRGS) super-expressando ureases ou o peptídeo recombinante, para avaliação da proteção conferida contra insetos fitófagos e fungos fitopatogênicos.

Para as referências bibliográficas do nosso grupo, acesse publicações selecionadas ou consulte o CV Lattes de Célia Carlini.

Referências:

Uversky VN (2002) What does it mean to be natively unfolded? Eur J Biochem 269, 2–12.

Uversky VN (2009) Intrinsically disordered proteins and their environment: effects of strong denaturants, temperature, pH, counter ions, membranes, binding partners, osmolytes, and macromolecular crowding. Protein J 28, 305–325.