Imunoquímica de proteínas

Anticorpos contra uma dada proteína podem ser ferramentas na identificação de proteínas (Western Blot, dot blot, ELISA), no estudo de interação proteína-proteína (co-imunoprecipitação) e na quantificação de proteínas ( ELISA).

Os anticorpos usados em qualquer uma das técnicas acima podem ser monoclonais ou policlonais. No caso de anticorpos monoclonais, eles reconhecem um epitopo específico de uma determinada proteína, proporcionando um resultado mais “específico”. No caso de anticorpos policlonais, eles podem reconhecer diversas regiões da proteína usada como antígeno ou mesmo reconhecer regiões idênticas ou similares daquela proteína em proteínas homólogas de outros organismos.

A seguir, serão apresentados os ensaios imunoquímicos mais utilizados.

1- Western Blot

Esta técnica é largamente utilizada para identificar proteínas, utilizando a reatividade de um anticorpo contra a proteína alvo como princípio. O diagrama abaixo ilustra as etapas de confecçào de um Western blot.

Western blot

Inicialmente as proteínas contidas em uma amostra complexa são fracionadas por eletroforese em gel de poliacrilamida, podendo ser unidimensional ou bidimensional. As proteínas fracionadas no gel são transferidas para uma membrana de nitrocelulose ou PVDF (fluoreto de polivinilideno). Esta transferência pode ser feita através do uso da corrente elétrica, ou simplesmente pela força da gravidade. Em seguida, será feito o bloqueio do restante da membrana, onde não houver proteína transferida. Geralmente o bloqueio é feito saturando-se a membrana com uma proteína não relacionada (para que não tenhamos uma reação cruzada), como caseína do leite, gelatina ou albumina. A próxima etapa é a aplicação do anticorpo primário, que reconhece a proteína de interesse. Em seguida, procede-se a aplicação do anticorpo secundário, responsável por reconhecer o primário, e também carregando uma sonda que será usada na revelação (visualização das bandas imunorreativas). As etapas duram cerca de 2 h cada, com lavagens entre elas. Ao final do processo, procede-se a revelação do Western blot, usando substratos para a sonda presa ao anticorpo secundário. Existem diversas variações desta técnica, que ao longo do tempo, serão adicionadas aqui.

westen blot HPU a e b condensed copy

A figura ao lado mostra um Western blot desenvolvido com anticorpos primários anti-HPU (classe IgG,  desenvolvido em coelhos). Após a transferência das proteínas do gel SDS-PAGE para a membrana, esta foi incubada com o anticorpo anti-HPU, e depois com um anticorpo anti-IgG de coelho, conjugado com peroxidase.  As bandas de proteína reconhecidas pelo anti-HPU foram reveladas através da reação da peroxidase com 3,3′-Diaminobenzidina (DAB), formando um precipitado roxo.

Nas canaletas do gel (P1) foram aplicadas amostras da cadeia α (lado esquerdo) ou da cadeia β (lado direito) isoladas da urease de Helicobacter pylori. A cadeia α tem 30 kKa e a cadeia β tem 60 kda. O anticorpo anti-HPU foi desenvolvido contra a proteína inteira, e portanto, é capaz de reconhecer as suas cadeias isoladas.  Na canaleta MW foi aplicado uma mistura de proteínas pré-coradas e com massa molecular conhecida, para servir de referência.

O resultado desse Western blot atesta o grau de pureza das amostras de cadeia α da HPU (somente uma banda é visível, na altura de 30 kDa). Já a amostra de cadeia β contem um predomínio dessa proteína, mas apresenta também a cadeia α em proporções menores.

 

2-ELISA: enzyme linked immuno sorbent assay

No caso do ELISA, a amostra é aplicada diretamente em placas de 96 poços, que são próprias para este ensaio. Estas placas são feitas de um material com alto poder de adsorver proteínas.  Uma vez que a amostra foi aplicada, procede-se o bloqueio da superfície não utilizada da placa, seguido da aplicação dos anticorpos primários e secundários, como foi feito com o Western Blot.  Novamente, uma sonda ligada ao anticorpo secundário será responsável pela reação de revelação. O ELISA possui diversas variações da metodologia. Além disso, podemos usar uma proteína padrão em diferentes quantidades para a montagem de uma curva padrão, e por isso, usar este ensaio de forma quantitativa.

Elisa

3- Imunoprecipitação e Co-imunoprecipitação:

A imunoprecipitação aproveita a formação do complexo antígeno-anticorpo como método para purificar um proteína de uma mistura complexa, desde que se tenha anticorpos específicos para ela. Para facilitar a precipitação, o anticorpo é imobilizado em uma partícula de agarose ou de látex. A imobilização do anticorpo pode ser feita por diversas técnicas, sendo a mais empregada a utilização de partículas  préviamente tratadas com Proteína A, ou Proteína G, que são proteínas bacterianas que apresentam alta afinidade por moléculas de IgG. Essas proteínas diferem em afinidade em relação à sub-classe de IgG e também a espécie animal. A figura ilustra as etapas de uma imunoprecipitação.

imunoprecipitação

Após incubar a resina contendo Proteína A (ou G) com o anticorpo específico, esta é adicionada à mistura contendo o antígeno. Após incubação, as  partículas contendo o complexo antígeno-anticorpo são recuperadas por centrifugação. A eluição da proteína de interesse (antígeno) é feita desastabilizando-se o complexo antígeno-anticorpo, através da adição de guanidinina ou uréia (agentes caotrópicos), alta concentração de sal, ou simplesmente água destilada.

A co-imunoprecipitação (Co-IP) é uma variante da imunoprecipitação empregada para investigar interações entre proteínas. Em um extrato bruto complexo, contendo uma proteína de interesse, temos diversas outras proteínas que podem estar interagindo com esta. No Co-IP, a ideia é usar um anticorpo contra a proteína de interesse com isca. Após incubação da amostra com o anticorpo para formar o complexo antígeno-anticorpo, este é precipitado com a resina Proteina A/G~agarose em condições brandas, de tal modo precipitar também outras proteínas que estejam interagindo com o antígeno. A identificação das proteínas que interagem com o antígeno pode então ser feita por várias técnicas, tais como sequenciamento de Edman ou espectrometria de massas.