Espectrometria de massas

Espectrometria de massas (Mass Spectrometry, MS) é uma técnica que consiste basicamente em determinar a relação de massa e carga (m/z) de um composto em fase gasosa. Este composto precisa estar ionizado para que possa ser detectado. A espectrometria de massas acoplada (MS/MS) é uma técnica analítica poderosa, usada para identificar compostos desconhecidos, quantificar compostos conhecidos e auxiliar na elucidação estrutural de moléculas. A MS/MS apresenta uma vasta gama de aplicações, como por exemplo: na ecologia, toxicologia, geologia, biotecnologia, e descoberta e desenvolvimento de fármacos.

Um espectrômetro de massas é dotado de três “partes” com funções  distintas, mas igualmente importantes:

  1. Fonte de ionização: é onde ocorre a ionização do composto a ser analisado. Em proteômica são largamente utilizadas as fontes do tipo ESI (electrospray) e MALDI (matrix-assisted laser desorption/ionization).
  2. Analisadores: este componente do equipamento é (ou são), responsável (is) pela análise do íon; é nesta parte do equipamento que ocorre a separação dos íons, que possuem diferentes valores de m/z. Os íons do analito são perturbados por campos elétricos ou magnéticos e a diferença de comportamento destes íons frente ao analisador é o que promove a sua separação. Cada íon possui uma determinada característica (alta carga, baixa carga, mais longo, mais curto, etc). Existem diversos tipos de analisadores de íons: tempo de vôo (TOF, time of flight); quadrupolo, triplo quadrupolo, armadilhas de íons (ion traps), orbitrap, entre outros. Geralmente, um espectrômetro possui mais de um analisador, com características distintas, permitindo explorar diferenças sutis entre os íons analisados.
  3. Detectores: responsáveis pela detecção dos íons analisados.

Apenas no início da década de 80, a espectrometria de massas começou a ser mais aplicada em determinações de massas moleculares de proteínas.  O termo proteômica foi cunhado na década de 1990, definindo a caracterização em larga escala do conjunto de proteínas expressas em uma célula ou tecido. A este conjunto de proteínas expressas em uma célula ou tecido, a partir do genoma, é denominado proteoma.

Nos estudos proteômicos, os íons analisados serão peptídeos oriundos de hidrólise de proteínas (como usado em abordagens botton up), ou mesmo proteínas intactas (como feito nas abordagens top down). As ionizações por electrospray e MALDI proporcionaram um grande avanço nas análises de peptídeos. Diferentes técnicas de fragmentação e analisadores mais robustos vêm contribundo significativamente para a maior cobertura de proteomas analisados.

O método mais clássico de identificação de proteínas por espectrometria de massas é denominado peptide mass fingerprinting (PMF). Esta metodologia é baseada na digestão da proteína a ser identificada por uma enzima proteolítica (por exemplo, a tripsina) produzindo peptídeos. As massas desses peptídeos são então determinadas com grande acuidade (0,1-0,5 Da). As massas obtidas formam uma espécie de impressão digital (peptide mass fingerprinting) da proteína. Softwares especiais permitem comparar o PMF da proteína analisada com os perfis gerados teoricamente para todas as seqüências de proteínas presentes nos bancos de dados, permitindo assim a identificação da proteína-alvo.

Em todos os casos, existe uma pergunta biológica por trás que deve ser respondida. O espectrômetro de massas “não sabe” o que está sendo analisado (lipídeo, proteína, açúcar, ou um metabólito qualquer). Para isso, o preparo de amostras é crítico e tão importante quanto a análise proteômica em si. Além do mais, existe uma grande dependência de boas ferramentas de bioinformática para a análise e processamento de dados coletados por espectrômetros de massas.

As modificações pós-traducionais de proteínas também são foco de estudos. As modificações podem ser de diversos tipos, tais como fosfoliração e glicosilação. A identificação de cada uma delas requer um preparo específico de amostra (geralmente procedimentos de extração ou cromatografias em que ocorre o enriquecimento dos peptídeos modificados), e ajustes específicos no espectrômetro para análise. O estudo de alterações nos padrões de modificações pós-traducionais tem ajudado a esclarecer as bases moleculares de patologias ou mesmo servir de biomarcadores de doenças.

Também existem as abordagens proteômicas quantitativas, através das quais proteínas e peptídeos podem ser quantificados por espectrometria de massas. Estas abordagens podem necessitar de padrões com marcações isotópicas, ou serem livres destas marcações, e podem proporcionar resultados absolutos (por exemplo, ng/mL)  ou relativos (comparando condições).

Sequenciamento de novo de proteínas

Para sequenciar proteínas, obtem-se o espectro MS/MS (duas etapas de MS acopladas) de seus peptídeos. Depois de fazer o MS de um peptídeo tríptico da proteína, este é fragmentado por colisão com gases, e os fragmentos são analisados num segundo passo de MS.

 

A ligação peptídica se quebra formando fragmentos típicos, como os íons b e y mostrados na figura, que terão massas diferentes de acordo com o radical R de cada aminoácido.

 

A sequência obtida pela análise dos íons de uma série, por exemplo íons b, pode ser confirmada pela determinação da sequência feita a partir da série complementar de íons, no caso, íons y.