Cromatografias

A Cromatografia é uma técnica de separação que usa como princípio a distribuição diferenciada dos componentes de uma mistura entre duas fases: uma móvel e uma estacionária. A fase móvel será constituída pela solução que carreará o analito em questão. Tratando-se de proteínas, na imensa maioria dos casos, será uma solução tamponante.  Já a fase estacionária é a matriz ou resina, geralmente um polímero funcionalizado na forma de partículas minúsculas. Esta funciona como um adsorvente que fará a interação com o analito (proteína ou peptídeo). Este tipo de interação define o tipo de cromatografia.

A cromatografia preparativa pode ser realizada com a resina acomodada em um funil com placa porosa, ao qual se adiciona a amostra, coletando-se em seguida a fração de proteínas não retidas. Em seguida, adiciona-se sucessivamente  tampões com diferentes composições, visando desestabilizar a interação da resina com proteínas que ficaram retidas, um processo denominado eluição.  A vantagem desse método é a rapidez com que se realiza a cromatografia, mas a capacidade de separação do processo fica comprometida.

Cromatografias analíticas e semi-preparativas são realizadas com a resina empacotada em colunas, que podem ter  diâmetro variando de milimetros a poucos centímetros, e ter até mais de um metro de comprimento. A velocidade da cromatografia em coluna é bem menor, mas ganha-se em resolução, uma vez que a interação entre a resina e as proteínas na amostra é maximizada.

coluna

 

O tamanho da partícula de resina também é importante para o resultado de uma cromatografia. Quanto menor o tamanho, maior a superfície de contacto disponível para interações. Por outro lado, partículas pequenas de resina oferecem muita resistência ao fluxo da fase móvel (o tampão).

HPLCEquipamentos denominados HPLC (high pressure liquid chromatography) utilizando bombas para pressurizar a fase móvel, tornaram possível realizar cromatografia em resinas com partículas de tamanho micrométrico. Além das bombas, um HPLC é composto de detectores que analisam a amostra na saída da coluna, um válvula que permite a injeção da amostra, o coletor de frações, um forno (no caso de colunas que precisam de aquecimento) e computador para controle de todo o processo.

 

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