Como Trabalhamos


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Nessa seção apresentaremos noções básicas das metodologias em uso no LaNeurotox, em especial aquelas metodologias aplicadas para isolar ou purificar uma proteína, para caracterizar aspectos físico químicos de uma proteína ou interações proteína-proteína.

Todos os textos e as explicações  são apresentadas a nível de um curso de graduação em áreas biológicas e afins.  Daremos destaque às técnicas de eletroforese, cromatografias diversas, espectrometria de massas, e ensaios imunoquímicos.

Para mais detalhes sobre as várias metodologias, visite o menu lateral.

O isolamento ou purificação de uma proteína (ou peptídeo) é uma etapa que precede os estudos de suas características físico-químicas, de sua estrutura 3D e a compreensão de suas propriedades biológicas.

Inicialmente, a estratégia de purificação de uma proteína é empírica, ou seja, baseada em tentativa-erro, e deve ser desenhada para cada proteína individualmente. Não há como prever quais métodos serão os mais eficientes para se purificar uma proteína pela primeira vez.

purificar

Os métodos de separação de biomoléculas são agrupados em duas categorias:

Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas:

  1. Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifugação, diálise, gel-filtração)
  2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese)
  3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia hidrofóbica, fase reversa)

Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas moléculas:

  1. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que interage é um “reagente” de fácil obtenção, disponível comercialmente).

 

purificar-2O fluxograma ao lado representa a “marcha” de purificação de uma proteína, mostrando etapas sucessivas, cada uma consistindo de método, que levam ao isolamento de uma proteína a partir  de uma mistura complexa.

Observe a quantidade de proteínas (100g) presente no material inicial e quanto da proteína purificada se obtém no final (0,001g). Esses números são típicos para a purificação da maioria das proteínas, em especial enzimas.

É essencial para uma purificação bem sucedida que se disponha de um ensaio biológico que possibilite detectar a proteína de interesse nas frações obtidas.  Em cada etapa, a proteína de interesse é separada das demais com base em uma propriedade físico-química diferente.  Consequentemente, as proteínas ainda misturadas com aquela que está sendo isolada são cada vez mais semelhantes em suas características físico-químicas, exigindo métodos cada mais sensíveis, capazes de explorar pequenas diferenças, para se chegar à proteína pura.