Fase Reversa

Esse método, assim como a cromatografia hidrofóbica,  também explora o caráter hidrofóbico de proteínas ou peptídeos, que se ligam, na ausência de sais e na presença de baixas concentrações de solvente orgânico, a uma resina hidrofóbica.fase reversa

 

Em geral utilizadas em equipamentos HPLC (high pressure liquid chromatography), as resinas de fase reversa são feitas de partículas de sílica derivatizadas com hidrocarbonetos de 2 C a 18 C. As partículas de tamanho micrométrico são empacotadas em colunas de aço inoxidável ou titânio, precisam ser submetidas a alta pressão para que ocorra o fluxo do eluente. fase reversa-resinas

A coluna é equilibrada em meio ácido (0.1% de ácido trifluoroacético) para aumentar a hidrofobicidade (protonar as carboxilas) das cadeias peptídicas. Por esta razão, essa metodologia é mais útil para peptídeos e proteínas pequenas, que resistem ao meio ácido. A eficiência da separação é influenciada pela temperatura, de modo que as colunas podem ser colocadas dentro de fornos que fazem parte do sistema HPLC.

fase reversa-cromatograma  Moléculas hidrofílicas são excluídas logo no início da cromatografia, por não se ligarem à matriz. Em seguida, a eluição das moléculas retidas é feita com aumento da concentração de solvente orgânico miscível com água, como acetonitrila, metanol e propanol,  desligando as proteínas e peptídeos ligados à matriz em ordem crescente de hidrofobicidade.