Afinidade

A cromatografia de afinidade é o único método de separação de biomoléculas que explora uma propriedade biológica da molécula de interesse, em geral uma proteína.  A separação de moléculas tem como base a interação específica do analito (molécula-alvo) com um ligante imobilizado em uma matriz.  As forças envolvidas nessa interação podem ser não covalentes  (eletrostáticas, hidrofóbica, pontes de H) ou covalentes.  A eluição das proteínas retidas na resina pode ser feita alterando  o tampão para condições que interferem na ligação da proteína ao ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou ainda por competição com o ligante livre.

Em geral, são os métodos mais eficientes para a purificação de proteínas, possibilitando um alto rendimento com número reduzido de etapas, preservando a atividade biológica da proteína de interesse.

A cromatografia de afinidade pode ser de dois tipos:

1. Mono-específica, quando explora uma  ligação específica da molécula-alvo:

  • anticorpo ou antígeno
  • análogos de substratos ou inibidores de enzimas
  • agonistas ou antagonistas de receptores
  • haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos
  • ligantes com “tag” ou “marcação” (ex: glutationa-S-transferase)

2. Grupo-específica, quando permite separação de grupos de  moléculas:

  • proteína A ou proteína G – anticorpos IgG
  • concanavalina A – glicoproteínas contendo glicose ou manose terminal
  • lisina – plasminogênio, RNA ribossomal
  • benzamidina – proteinases tipo tripsina
  • calmodulina – proteínas reguladas por calmodulina
  • heparina – fatores de coagulação, lipases, hormônios, etc.
  • metais de transição, como Ni2+ – proteínas e peptídeos com resíduos expostos de histidina ou marcados com cauda poli-histidina
  • análogos de nucleotídeos – enzimas que hidrolisam nucleotídeos

Muitas resinas para cromatografia de afinidade podem ser obtidas comercialmente. No caso de uma resina não ser disponível no mercado, esta pode ser sintetizada no laboratório.

 

afinidade

 

As duas formas mais utilizadas são a cromatografia de imunoafinidade e a de metal imobilizado.

1 Interação antígeno e anticorpo (imunoafinidade)

Esta cromatografia explora a especificidade dos anticorpos para os seus antígenos. Os anticorpos  (classe IgG) contra um antígeno específico (analito) são imobilizados em resinas do tipo proteína A ou G, em um suporte que pode ser partículas de agarose ou magnéticas.  Estas proteínas de origem bacteriana tem alta afinidade por anticorpos.  Uma vez a resina “carregada” com o anticorpo, será possível isolar de uma mistura complexa o antígeno específico reconhecido por este anticorpo, passando-se o material na coluna.  A eluição é feita por choque osmótico (IgG não “gosta” de água) ou de pH. Variações desta técnica permitem explorar interações proteína-proteína, como ensaios de co-imunoprecipitação (Co-IP).

2 Metal imobilizado (IMAC)

A IMAC (immobilized metal affinity chromatography) explora a afinidade de algumas proteínas por íons metálicos, determinada pela presença de certos aminoácidos em sua superfície, particularmente histidinas. A reversibilidade da interação da biomolécula com o íon metálico, em geral níquel, cobalto, ou zinco, depende do caráter ácido-básico desses metais.

NTA-Ni

Esse tipo de cromatografia é muito útil para a purificação de proteínas recombinantes nas quais é introduzida uma cauda poli-histidina. Resinas que podem quelar metal (p.ex.. contendo grupamentos de ácido nitritotriacético – NTA), carregadas com níquel, são utilizadas para esse fim. Ver figura ao lado. A proteína recombinante terá alta afinidade por níquel, devido a sua cauda poli-histidina, que interagirá com o Ni. A eluição da proteína ocorrerá apenas com altas concentrações de imidazol, que por ser parte do aminoácido histidina, compete com o metal imobilizado, deslocando a proteína recombinante.