Canatoxina

Canatoxina-feijão de porco

Canavalia ensiformis, feijão-de-porco.

O feijão-de-porco Canavalia ensiformis (Jack bean em inglês) é uma leguminosa de distribuição pan-tropical, robusta e resistente a pragas, com sementes ricas em proteínas, carboidratos e óleo. As sementes, no entanto, são tóxicas mesmo após tratamento térmico, impedindo seu aproveitamento como alimento para homens ou animais.

Inicialmente, a toxicidade das sementes foi atribuída à lectina concanavalina A, uma proteína hemaglutinante, capaz de se ligar com alta afinidade a resíduos de glicose e manose, presentes na superfície de células. 

Em 1981, isolamos a canatoxina (CNTX) das sementes de Canavalia ensiformis, uma proteína com ação neurotóxica convulsivante e letal, quando injetada em camundongos e ratos (DL50 ~2 mg/Kg), mas inócua quando administrada por via oral.

Em estudos subsequentes, pudemos demonstrar que, in vitro, a CNTX liga-se a diferentes glicoconjugados como mucinas  e gangliosídeos polisialilados, e induz exocitose e secreção em diversos tipos celulares como plaquetas (Carlini et al., 1985), mastócitos, macrófagos (Barja-Fidalgo et al., 1992a), ilhotas pancreáticas, sinaptosomas (Barja-Fidalgo et al., 1991a, b), etc.

A CNTX tem ação pro-inflamatória em ratos e camundongos, ativando neutrófilos e macrófagos (Benjamin et al., 1992; Barja-Fidalgo et al., 1992b). A maioria dos efeitos causados pela CNTX é mediado por eicosanóides derivados do ácido araquidônico por ação de lipoxigenases (Barja-Fidalgo et al., 1991b) , e envolve alterações dos níveis intracelulares de íons cálcio (Ghazaleh et al., 1997).

SDS-PAGE

SDS-PAGE de proteínas extraídas de sementes de Canavalia ensiformis. (da esquerda para a direita) Marcadores de massa molecular (Mr), CNTX, urease (JBU), concanavalina A (Con A), e extrato bruto das sementes.

Em 2001, após 20 anos de estudos dedicados principalmente ao estudo da sua atividade neurotóxica e de suas propriedades farmacológicas, descobrimos que a CNTX é uma variante da enzima urease presente na mesma semente (Follmer et al., 2001).

A urease (JBU, Jack bean urease) da Canavalia ensiformis é um hexâmero de subunidades de 840 aminoácidos, contendo 2 átomos de níquel por subunidade. A CNTX é um dímero de cadeias de 95 kDa ligadas não covalentemente, apresenta cerca de 40% da atividade enzimática da urease, e contem 1 átomo de zinco e 1 mol de níquel por subunidade (Follmer et  al., 2002).

A JBU possui parte das propriedades biológicas da CNTX, como ativação de plaquetas e ligação a gangliosídeos, mas não é tóxica se injetada i.p. em camundongos. Ambas as ureases são letais e convulsivantes quando administradas por via endovenosa. Esses efeitos independem da atividade ureolítica das proteínas, persistindo nas moléculas tratadas com o inibidor p-hidroxi-mercuribenzoato, implicando que outros “domínios” protéicos das moléculas são os responsáveis por essas atividades (Follmer  et  al., 2001; 2004a).

Do ponto de vista físico-químico, mostramos que a CNTX difere da urease majoritária (JBU) em vários aspectos, além do estado de oligomerização e presença de metais, tais como a sensibilidade a inibidores da atividade ureolítica, comportamento em cromatografia de afinidade em metal imobilizado (Follmer et al., 2001; 2004b), interação com gangliosídeos, conteúdo de estrutura secundária (mestrado de Rafael Real Guerra), etc.

Tentativas de clonar um cDNa que codifique a CNTX resultaram infrutíferas até o momento. Estudos de seqüenciamento da proteína mostram alta similariedade com a urease principal (JBU) e sugerem que a CNTX possa ser um produto de “splicing” alternativo do gene da JBU. A clonagem do  DNA genômico da JBU,  em andamento no laboratório, nos permitirá investigar essa hipótese. Alternativamente, a CNTX pode ser um estado oligomérico (conformêro) menor da própria JBU, possibilidade que está sendo estudada no doutorado de Carlos Gabriel Moreira de Almeida.


Papel fisiológico da canatoxina e ureases em vegetais

Proteínas canatoxina-like e ureases estão presentes em várias plantas e acumulam-se na semente madura (Barcellos et al., 1993), sugerindo que essas moléculas participem na biodisponibilização de nitrogênio para a plântula em desenvolvimento, bem como de mecanismos de defesa da planta.

Em 1997, descrevemos o efeito inseticida da CNTX quando ingerida por insetos como o caruncho do feijão de corda (Callosobruchus maculatus) e o barbeiro, Rhodnius prolixus (Carlini et al., 1997).

Callosobruchus

Adultos do caruncho Callosubruchus maculatus (em cima). As larvas se desenvolvem dentro de sementes do feijão-de-corda, danificando-as (em baixo). As manchas circulares escuras são galerias formadas pelas larvas ao se alimentarem dos cotilédones.

 

Em 1997, descrevemos o efeito inseticida da CNTX quando ingerida por insetos como o caruncho do feijão de corda (Callosobruchus maculatus) e o barbeiro, Rhodnius prolixus (Carlini et al., 1997).

Em 1999, observamos que a CNTX possui propriedades antifúngicas contra fungos fitopatogênicos (Oliveira et al., 1999).

Posteriormente, demonstramos que outras ureases, isoladas de diferentes organismos, possuem atividade inseticida (Follmer et al., 2004a) e antifúngica não relacionada com a atividade enzimática dessas proteínas.


 

Para as referências bibliográficas do nosso grupo, acesse publicações selecionadas ou consulte o CV Lattes de Célia Carlini.